當(dāng)前的COVID-19疫情極大地加速了mRNA技術(shù)在我們現(xiàn)實(shí)世界中的應(yīng)用，在這場(chǎng)戰(zhàn)斗中，mRNA證明了它與傳統(tǒng)生物制藥和疫苗技術(shù)相比的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。為了克服人體生理環(huán)境中mRNA的不穩(wěn)定性，mRNA的納米遞送系統(tǒng)是其體內(nèi)應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。納米遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)遞送系統(tǒng)（脂質(zhì)納米顆粒和脂質(zhì)體）、聚合物復(fù)合物、膠束、陽離子肽等。總而言之，mRNA的應(yīng)用范圍很廣，它的時(shí)代才剛剛開始。

一、 為什么需要納米遞送系統(tǒng)？

核酸的分子量比較大（104-106 Da）并且?guī)в胸?fù)電荷，因此很難通過細(xì)胞的陰離子脂質(zhì)雙層膜，此外，由于mRNA是單鏈大分子，較為脆弱，細(xì)胞外的存在也會(huì)限制mRNA的傳遞，例如被先天免疫系統(tǒng)中的吞噬細(xì)胞所吞噬或者被核酸酶降解，都會(huì)導(dǎo)致靶細(xì)胞攝取效率低，體內(nèi)釋放不成功等問題。電穿孔、基因槍以及離體轉(zhuǎn)染可以向培養(yǎng)皿中的細(xì)胞遞送mRNA，然而，在實(shí)際人體中遞送時(shí)，則需要納米遞送系統(tǒng)，用以避免毒性以及不必要的免疫原性。

幸運(yùn)的是，為了實(shí)現(xiàn)mRNA的有效遞送已經(jīng)開發(fā)了許多基于材料的創(chuàng)新解決方案。目前最常用的納米遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）、脂質(zhì)體、脂質(zhì)復(fù)合物、高分子聚合物、膠束、多肽、魚精蛋白、電穿孔等。LNPs和脂質(zhì)體是最有前途的mRNA遞送工具之一。

二、 納米遞送系統(tǒng)

圖1.mRNA的遞送系統(tǒng)及應(yīng)用

2.1 脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）

圖2.LNP結(jié)構(gòu)示意圖

LNPs目前是基因治療的主要非病毒遞送載體。隨著LNP介導(dǎo)的siRNA治療劑Onpattro® (patisiran)獲批上市，mRNA遞送領(lǐng)域最先想到的就是采用LNPs遞送。 如圖所示：LNPs是一種具有磷脂單層結(jié)構(gòu)的生物相容性載體，可以將mRNA包裹在核中以避免降解。除了帶負(fù)電荷的mRNA外，LNP通常還有其他四種成分：可電離的陽離子脂質(zhì)、中性輔助磷脂、膽固醇和PEG化脂質(zhì)。

中性輔助磷脂一般為飽和磷脂，可提高整體相變溫度和穩(wěn)定性。

膽固醇具有很強(qiáng)的膜融合能力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)mRNA的攝入和細(xì)胞質(zhì)的進(jìn)入。

PEG化脂質(zhì)位于其表面以提高其親水性，避免被免疫系統(tǒng)快速清除，防止顆粒聚集，增加穩(wěn)定性。

可電離的陽離子脂質(zhì)，它是mRNA遞送和轉(zhuǎn)染效率的決定性因素。它需要在生理?xiàng)l件下（pH≈7.0）非電離，但在酸性條件下電離（pH=5.0）。此時(shí)叔胺頭部質(zhì)子化，形成離子化頭部和疏水鏈尾部，進(jìn)而形成錐形結(jié)構(gòu)，促進(jìn)內(nèi)涵體/溶酶體膜向六方晶相轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)高效遞送和轉(zhuǎn)染。羧酸酯的存在保證了陽離子脂質(zhì)在體內(nèi)的可降解性，避免了脂質(zhì)聚集帶來的毒副作用。

LNP可通過快速混合進(jìn)行制備，目前主流的方法是通過微流體制備，將含有mRNA的乙醇溶液添加到過量的水中，然后與脂質(zhì)迅速混合，自組裝包裹mRNA后形成納米顆粒。

目前上市的兩款mRNA新冠疫苗使用的就是LNP遞送mRNA。

表1.兩款mRNA新冠疫苗LNP組分對(duì)比

除了上述兩款上市mRNA新冠疫苗中的兩款LNP，還有許多新型LNP在研發(fā)階段且極具價(jià)值。不同的材料對(duì)LNP的性質(zhì)有很大的影響。

l Aguado課題組開發(fā)了四種具有不同成分的LNP用于mRNA遞送，并且通過對(duì)比，DOTAP作為陽離子脂質(zhì)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，并且伴隨著多糖的加入而提高了穩(wěn)定性。

表2.不同配方的四種LNP

圖3.三種陽離子結(jié)構(gòu)

l Davies課題組則發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)皮下注射含有mRNA的LNP時(shí)，可以在血漿中產(chǎn)生可測(cè)量的分泌蛋白，但會(huì)受到相關(guān)炎癥因子的影響。 為了克服這一局限，構(gòu)建了由MC3陽離子脂質(zhì)和L608陽離子脂質(zhì)組成的LNPs，其蛋白表達(dá)持續(xù)時(shí)間延長，可實(shí)現(xiàn)慢性病治療性蛋白的系統(tǒng)水平穩(wěn)定。

圖4.MC3和L608陽離子脂質(zhì)結(jié)構(gòu)

l Billingsley課題組研究了靶向治療嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）的療效，該療法具有誘導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病和B細(xì)胞淋巴瘤患者緩解的能力。然而，使用病毒載體可以誘導(dǎo)永久性的CAR表達(dá)，這可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此為了降低不良反應(yīng)的毒性，他們?cè)O(shè)計(jì)了LNP用作mRNA體外遞送到人體T細(xì)胞中，并從24個(gè)可溶性脂質(zhì)庫中發(fā)現(xiàn)7種能增強(qiáng)療效緩解癥狀的LNP。

圖5.A烷基鏈；B篩選庫；C合成反應(yīng)

除此以外，還有更多課題組致力于LNP的研發(fā)，不同的LNP具有不同的靶向和效果，甚至有課題組設(shè)計(jì)研發(fā)出可霧化的脂質(zhì)納米顆粒，用于肺部的疾病治療。

雖然LNP是mRNA遞送的最有效手段之一，但存在幾乎無窮無盡的設(shè)計(jì)空間，需要耗費(fèi)大量人力物力及時(shí)間成本對(duì)其進(jìn)行修改，以實(shí)現(xiàn)高效，無毒的靶向特定組織，器官或細(xì)胞的LNP制劑。此外，穩(wěn)定性差使得mRNA-LNP的運(yùn)輸和儲(chǔ)存成本很高。它的長期存儲(chǔ)也是發(fā)展mRNA-LNP體系需要重點(diǎn)考慮的問題之一。

2.2 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由磷脂雙層形成的球形封閉囊泡。脂質(zhì)體由A. D. Bangham于1965年首次發(fā)現(xiàn)，并長期用于小分子藥物遞送，粒徑范圍為20nm至1000nm。除了小分子化療藥物的封裝外，越來越多的研究集中在基因藥物（包括mRNA，pDNA，siRNA等），蛋白質(zhì)藥物，激素藥物等脂質(zhì)體的封裝和遞送能力上。陽離子脂質(zhì)體帶正電荷，主要由陽離子脂質(zhì)組成，陽離子脂質(zhì)能夠以靶向方式有效地濃縮核酸。此外，通過改變陽離子脂質(zhì)體的物理和化學(xué)性質(zhì)，例如調(diào)整粒徑的大小和修飾陽離子脂質(zhì)體的表面，可以在體內(nèi)獲得良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。一般來說，脂質(zhì)體的制備方法包括薄膜分散法、溶劑注射法、冷凍干燥法、pH梯度法等

圖6.陽離子脂質(zhì)體包封mRNA的結(jié)構(gòu)示意圖

目前用于制備脂質(zhì)體的材料眾多，包含特殊的陽離子脂質(zhì)，磷脂以及實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體隱形的PEG化脂質(zhì)。

表3.用于mRNA遞送的脂質(zhì)體常用材料

通過脂質(zhì)體遞送mRNA有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，脂質(zhì)體是球形囊泡，可以封裝mRNA并抵抗核酸酶。其次，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜相似，易于與受體細(xì)胞融合，轉(zhuǎn)染效率高。第三，作為一種遞送系統(tǒng)，脂質(zhì)體不受宿主限制。最后，磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)高度模擬細(xì)胞膜。它是生物進(jìn)化理論中已知的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)異的長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

l Miche課題組通過薄膜分散法制備陽離子脂質(zhì)體，并包封mRNA。脂質(zhì)體由DC-CHOL / DOPE組成，該制劑即使在室溫下儲(chǔ)存80 d仍可以保持穩(wěn)定。

l Kuznetsova課題組利用三苯基膦，采用非共價(jià)手段修飾后DPPC脂質(zhì)體。與十四烷基咪唑烴尾表面活性劑相比，脂質(zhì)體可以維持4個(gè)月以上的穩(wěn)定性。

l Mai課題組通過薄膜分散法制備了由DOTAP/CHOL/DSPES-PEG組成的陽離子脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體，mRNA和魚精蛋白以10：1：1的比例混合，形成了穩(wěn)定的脂質(zhì)體/魚精蛋白-mRNA復(fù)合物。通過鼻腔給藥，該脂質(zhì)體核酸藥物顯示出極大的效率和刺激樹突狀細(xì)胞成熟的能力，并可以進(jìn)一步誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

l Zhang R課題組用膽固醇修飾的陽離子多肽DP7對(duì)DOTAP脂質(zhì)體進(jìn)行了修飾。修飾后的DOTAP脂質(zhì)體具有了跨膜結(jié)構(gòu)和免疫輔助功能，同時(shí)也提高了個(gè)性化新抗原mRNA遞送的效率，并增強(qiáng)了激活樹突狀細(xì)胞（DC）的能力。

l Huang H課題組首先利用脂質(zhì)體包裹了編碼RBD區(qū)域的mRNA，該mRNA脂質(zhì)體復(fù)合物可以在體內(nèi)表達(dá)RBD并成功誘導(dǎo)接種小鼠產(chǎn)生針對(duì)SARS-CoV-2的特異性抗體，有效的中和了SARS-CoV-2假型病毒。

然而，盡管mRNA已經(jīng)成功地通過脂質(zhì)體遞送，但脂質(zhì)體也有一些缺點(diǎn)。與LNP相比，脂質(zhì)體制備和mRNA包封的生產(chǎn)過程要復(fù)雜得多。一般來說，LNP和脂質(zhì)體都是脂質(zhì)納米顆粒。它們有許多相似之處，也有很大的不同之處。

表4.LNP和Liposome異同之處

2.3 聚合物復(fù)合物

高分子量聚合物材料（分子量10-106）化合物，通常是通過簡單結(jié)構(gòu)單元之間的共價(jià)鍵反復(fù)連接形成叫高分子量的復(fù)合物，例如殼聚糖，聚乙烯亞胺，聚氨酯等。大多數(shù)用于mRNA遞送的聚合物材料需要通過修飾以提高其轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性。聚乙烯亞胺（PEI）系統(tǒng)成功地將mRNA遞送到細(xì)胞和鼻腔內(nèi)。

l Soliman課題組通過靜電絡(luò)合作用制備了含有mRNA的納米顆粒，其由不同程度的脫乙酰化和磺化高分子組成。結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸和殼聚糖的聚合物長度和電荷密度，直接影響了與mRNA的親和力及其轉(zhuǎn)染效率

l Choia課題組則報(bào)道了一種mRNA遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用的是氧化石墨烯（GO）-聚乙烯亞胺（PEI）復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)GO-PEI復(fù)合物對(duì)于mRNA的有效負(fù)載以及保護(hù)mRNA免受核酸酶的降解非常有效。GO-PEI/RNA復(fù)合物處理細(xì)胞的動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)顯著提高了重編程效率。

l Chiper課題組通過化學(xué)修飾伯胺到芳香族結(jié)構(gòu)域，制備了1.8 kDa的聚乙烯亞胺（PEI）顆粒。這種修飾不僅不會(huì)影響聚乙烯亞胺的緩沖能力，還可以增強(qiáng)其pH敏感聚集，穩(wěn)定細(xì)胞外復(fù)合物，同時(shí)仍然允許核酸進(jìn)入細(xì)胞后有效釋放。

圖7. Chiper課題組化學(xué)修飾PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.4 膠束

膠束是指在表面活性劑濃度達(dá)到水溶液中一定值后開始大量形成的有序分子聚集體。在膠束中，表面活性劑分子的疏水基團(tuán)聚集形成膠束的核心，親水極性基團(tuán)形成膠束的外層。

l Roloff 課題組研究了一種新型RNA聚合物兩親性分子組裝成球形膠束，直徑約為15-30nm，研究證明它們可以在不使用轉(zhuǎn)染試劑的情況下有效地進(jìn)入活細(xì)胞。

圖8. Roloff 課題組研發(fā)的膠束

l Chan課題組則提出使用專門定制的多鏈氨基酸將mRNA靜脈遞送到小鼠的大腦中。這種結(jié)構(gòu)最終將凝結(jié)成一個(gè)介于24至34nm之間的多鏈納米。然后，熒光素酶（Luc2）的mRNA作為報(bào)告基因通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）并隨后通過腦室內(nèi)（ICV）注射將多鏈氨基酸注入小鼠大腦以繞過血腦屏障（BBB）。研究顯示，多重鏈納米結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較好的mRNA遞送效率，并且沒有顯著的免疫應(yīng)答記錄，可應(yīng)用于腦部疾病的治療。

2.5 陽離子多肽

基于多肽的遞送是一種較少被探索的系統(tǒng)，目前只有魚精蛋白（CureVac的狂犬疫苗）在臨床試驗(yàn)中被評(píng)估。新的遞送方法包括使用陽離子細(xì)胞穿透肽（CPP）和陰離子肽。CPPs系統(tǒng)已被證明可以改善體內(nèi)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，并在體外增強(qiáng)DC和人癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。與陰離子肽偶聯(lián)的mRNA多鏈體在DC細(xì)胞中表現(xiàn)出細(xì)胞攝取的增加而不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。

圖9. 多肽遞送系統(tǒng)示意圖

鑒于mRNA的巨大應(yīng)用潛力，隨著越來越多關(guān)于mRNA納米遞送系統(tǒng)研究的開展，勢(shì)必會(huì)有更多轉(zhuǎn)染效率更強(qiáng)、毒性更低、穩(wěn)定性更好的新型遞送載體。

我司專注于提供品質(zhì)高核酸遞送輔料，關(guān)于LNP和Liposome的輔料均有品質(zhì)高現(xiàn)貨供應(yīng)。

核酸遞送路漫漫，一路都有AVT相伴。

Reference：

[1]. Li M, Li Y, Li S, Jia L, Wang H, Li M, Deng J, Zhu A, Ma L, Li W, Yu P, Zhu T. The nano delivery systems and applications of mRNA. Eur J Med Chem. 2022 Jan 5;227:113910. doi: 10.1016/j.ejmech.2021.113910. Epub 2021 Oct 8. PMID: 34689071; PMCID: PMC8497955.