mRNA的特異性遞送是質粒DNA的絕佳替代品，因為后者具有隨機整合到宿主基因組中的潛在風險。隨著mRNA修飾技術和遞送技術的發展，其應用前景越來越廣闊。

一、 感染性疾病

mRNA疫苗可以同時激活細胞和體液免疫兩種機制，達到高保護率。mRNA疫苗的研究對象是具有強傳染性和高危害性的RNA病毒，如嚴重急性呼吸系統綜合征（SARS-CoV-2）、甲型流感病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、寨卡病毒（Zika）、人類免疫缺陷病毒（HIV-1）、埃博拉病毒（EBOV）等。

1.1 新冠疫苗

近幾十年來，mRNA疫苗的發展和技術突破，為它在SARS-CoV-2大流行期間的迅速崛起奠定了基礎。SARS-CoV-2是一種新型的β-冠狀病毒。SARS-CoV-2在其（+）RNA基因組中至少編碼29種蛋白質，其中四種是結構蛋白質：刺突（S），膜（M），包膜（E）和核衣殼（N）蛋白。SARS-Cov-2病毒體主要由膜（M）蛋白和包膜（E）蛋白組成的包膜，內部包載單鏈陽性RNA病毒以及核衣殼（N）蛋白。表面的刺突（S）蛋白負責感染宿主細胞，這也是中和抗體的主要位點，容易發生突變，而mRNA疫苗可以通過根據突變菌株的突變基因更新其序列來快速應用。治療性mRNA進入細胞質后，可被翻譯成S蛋白，進而誘導免疫應答。同時，mRNA疫苗還利用人體自身的分子機制，體內制造抗原縮短了免疫反應時間。

圖1.COVID-19病毒樣貌圖

圖2.mRNA疫苗作用機制

COVID-19在世界范圍內造成了一場充滿挑戰和威脅性的大流行，造成了巨大的健康和經濟損失。FDA已授予BNT162b2（輝瑞/BioNTech）和mRNA-1273（Moderna）的緊急使用授權。它們都是由LNP包裹編碼S蛋白的mRNA制備而來。BNT162b2已被推薦用于16歲及以上的人，劑量為30μg，在預防SARS-COV-2感染方面有效率為95%。mRNA-1273則被推薦給18歲及以上的人，劑量為100μg，預防SARS-CoV2感染方面有效率為94.5%。然而，兩種疫苗均報告了一些相關的過敏癥狀，包括注射部位的疼痛、發紅、發熱、疲勞、頭痛和肌肉疼痛。據報道，與mRNA-1273相比，BNT162b2的不良反應發生率較低；然而，mRNA-1273在運輸和儲存方面更穩定。

圖3.兩款mRNA疫苗研發時間線

1.2 流感疫苗

Martinon課題組證明了通過對動物進行皮下注射mRNA脂質體疫苗，可以在動物體內誘導產生細胞毒性T淋巴細胞滅殺流感病毒。流感疫苗是第一個嘗試使用mRNA技術進行預防疾病的疫苗。

Petsch課題組設計了多價mRNA疫苗，在動物體內評估了疫苗預防甲型流感（H1N1），H3N2和H5N1病毒的作用。這種皮內注射的mRNA疫苗可誘導產生特異性中和抗體，并保護動物免受甲型流感病毒的侵害。

除此以外，Moderna通過肌內注射針對甲型禽流感病毒H10N8和H7N9的mRNA疫苗已被證明是安全和有效的。

1.3 狂犬病疫苗

mRNA疫苗的保護作用已被證明在呼吸道病原體之外依舊是有用的。目前CureVac已經在其狂犬病疫苗候選產品CV7202的I期試驗中，評估了該疫苗的安全性，反應性和免疫反應。值得一提的是，起初CureVac的一代狂犬病疫苗CV7201采用的遞送載體是魚精蛋白，但是由于其轉染效率并不是很好，所以二代苗改為使用LNP進行遞送。

Lou課題組則發現，使用LNP遞送自編碼狂犬病病毒糖蛋白（RVG）的擴增mRNA可以對狂犬病病毒起到一個良好的保護作用。他們比較了幾種常用的陽離子脂質，然后選擇了DOTAP以及DDA，它們在誘導抗原表達方面最有效，后續將使用動物實驗進一步評估由它們形成的LNP-mRNA的疫苗效果。

1.4 Zika病毒疫苗

Pardi課題組提出了一種二價mRNA疫苗，該疫苗使用的是在2013年爆發中編碼寨卡病毒株的前葉和包膜糖蛋白的mRNA。單劑疫苗，封裝在LNP中并通過皮內遞送，疫苗接種后兩周至五個月內，可以保護小鼠免受病毒的攻擊。

Moderna也使用了相同的抗原，通過包封未修飾mRNA開發了一種針對寨卡病毒的疫苗-mRNA-1893疫苗，該疫苗獲得了FDA的快速批準，并正在進行I期試驗，以評估其安全性、耐受性和免疫原性。研究也證實：mRNA-1893可以在感染的小鼠模型成功阻止病毒的傳播。

1.5 CMV疫苗

John課題組設計了一種巨細胞病毒（CMV）疫苗，用于預防懷孕期間和移植患者的CMV感染。該疫苗由六種編碼CMV糖蛋白和五聚體復合物，經過修飾的mRNA組成，并以LNP的形式肌內注射。單劑量注射后，在小鼠和非人靈長類動物中引起了強烈的免疫反應，目前正處于由Moderna（mRNA-1647）贊助的臨床試驗中。

1.6 基孔肯雅熱疫苗

除了增強主動免疫外，mRNA還可用于被動免疫。Moderna的候選藥物mRNA-1944旨在提供針對基孔肯雅熱病毒的被動保護。從自然感染幸存者的B細胞中分離出超強效抗體，其序列被編碼成mRNA分子，封裝在LNP中，并通過輸注遞送進小鼠體內。在基孔肯雅熱小鼠模型中遞送mRNA-1944后，評估其保護能力。對非人靈長類動物的進一步研究也表明，mRNA-1944具有持久的免疫原性作用。

1.7 新生兒皰疹

Latourette II課題組選擇在交配前的雌性小鼠進行免疫來評估mRNA-LNP和蛋白質疫苗對新生兒皰疹的保護作用，然后比較了母體和幼鼠中的中和抗體水平。這兩種疫苗都保護了第一胎和第二胎免受播散性感染，并被證明可有效預防新生兒皰疹。

二、 腫瘤

mRNA腫瘤疫苗的目的是強化細胞介導的免疫反應，例如典型的T淋巴細胞反應，從而達到在不傷害正常細胞的情況下，去除或減少腫瘤細胞的目的。STING被認為是先天免疫和適應性免疫調節因子的中心。當受到刺激時，STING會誘導I型干擾素。細胞因子和T細胞募集因子的表達導致巨噬細胞的天然效應細胞樹突狀細胞（如NK）和腫瘤特異性T細胞，它們不僅可以在體內表達抗原，還可以激活STING信號通路，并顯著增強腫瘤抗原特異性免疫應答。這也意味著mRNA疫苗可以與其他腫瘤學療法（如檢查點抑制劑和免疫激動劑）聯合使用，以實現更全面的腫瘤學治療效果。

Moderna，BioNtech和CureVac是致力于mRNA技術的三巨頭，在mRNA腫瘤疫苗上投入了大量資金。幾種mRNA腫瘤疫苗目前正在臨床試驗中。

mRNA-5671靶向KRAS，目前正在NSCLC，結直腸癌以及胰腺癌中，具有晚期或轉移性KRAS突變的患者中進行評估。

mRNA-4157是Moderna的另一種癌癥疫苗，但與mRNA-5671不同，它是黑色素瘤的個體化治療疫苗。在這種方法中，對患者的腫瘤進行基因測序和生物信息學分析，以鑒定20個患者特異性新抗原表位，這些表位由為個體患者制造的mRNA結構編碼。

BNT122（II期）旨在治療局部晚期或轉移性實體瘤，包括黑色素瘤，非小細胞肺癌和膀胱癌。BioNtech還有許多其他抗腫瘤疫苗正在開發中，例如用于晚期黑色素瘤的BNT111，BNT112用于治療針對前列腺癌，BNT114用于三陰性乳腺癌，BNT115用于卵巢癌等。BNT113是抗HPV16衍生的癌蛋白E6和E7，它們存在于HPV16陽性的實體癌中，例如頭頸部鱗狀細胞癌。

表1. mRNA三巨頭的腫瘤候選疫苗研發

除上表中的疫苗情況，陽離子脂質體在mRNA腫瘤疫苗中得到了廣泛的研究，尤其是已在多種腫瘤中進行了臨床前研究。

表2.用于腫瘤候選疫苗中的脂質

mRNA疫苗將一些外源性基因表達產物直接作用于免疫細胞，促進免疫細胞的生長和增殖。因此可以通過增強T細胞的抗原反應來增強宿主的抗病毒和抗腫瘤作用。

三、 心血管疾病

越來越多的研究表明，RNA在靶向以前參與心血管疾病發展和進展的途徑方面具有很高的實用性。盡管在治療方案方面取得了重大進展，但心血管疾病仍然是世界頭號死因。

Mipomersen是最早治療心血管疾病的核酸療法之一，它是一種寡核酸（ASO）藥物，靶向編碼載脂蛋白B-100的mRNA。經過化學修飾的ASO可以減少其毒性。在最近一項ASO針對脂蛋白mRNA的II期試驗中，超過90%的患者在每周注射20mg或每4周注射60mg后，脂蛋白（a）的濃度低于50mg/dl。

另一個已經進入臨床試驗的ASO是volanesorsen。該ASO可以皮下注射，并通過結合APOC3 mRNA并促進其降解來發揮作用。在一項II期研究中，Volanesorsen降低了Apoc-II（-80%）和甘油三酯（-71%），HDL-膽固醇水平升高（46%）。降低膽固醇的另一種方法是靶向編碼酶前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/酮（PCSK9）的mRNA，該酶主要在肝臟中產生。

除了抑制內源性mRNA的藥物外，第一種進入臨床試驗的心血管相關mRNA藥物是Moderna設計研發的編碼血管內皮生長因子（VEGF）-A的mRNA。在一項I期研究中，皮內注射VEGF-A mRNA可導致2型糖尿病患者局部VEGF-A蛋白表達增加（經皮膚微透析評估）和皮膚血流量增加。根據這些結果，一項2a期臨床試驗將確定該mRNA治療藥物是否能恢復冠狀動脈疾病患者缺血但可行的心肌區域，如射血分數評估。這是一項隨機、雙盲、安慰劑對照、多中心研究，針對接受冠狀動脈搭橋手術的中度收縮功能受損患者。通過心外膜注射將患者隨機分配到枸櫞酸鹽緩沖液中的0mg，3mg或30mg VEGF-A mRNA劑量。如果這項計劃工作成功，它將提供證據，證明將mRNA直接注射到缺血組織中可以改善灌注和功能。

圖3.moderna與阿斯利康合作共研的心肌缺血藥物

四、 其他疾病

4.1 遺傳性疾病

Patel課題組使用了微流控技術制備了11個脂質納米顆粒，并測試了它們將mRNA遞送到眼球后部的能力。研究表明，含有低pKa和不飽和脂質鏈的LNP，在視網膜中具有最多的基因轉染劑量，并且基因表達動力學顯示，mRNA快速啟動（在4小時內）并且可以持續96小時。眼部的基因遞送具有細胞類型特異性，在視網膜色素上皮（RPE）中表達最多，在神經膠質細胞中表達有限，實驗也表明，通過LNP遞送mRNA可用于治療RPE的單基因視網膜退行性疾病并預防失明。

4.2 免疫系統不成熟

Riley課題組研究了在子宮內使用LNP來克服由于胎兒體積小而導致的免疫系統不成熟。他們開發了一個LNP庫，用于將mRNA遞送到子宮內的小鼠胎兒。利用LNP遞送熒光素酶mRNA進行了篩選，并且與具有更高效率和安全性的基準遞送系統相比，LNP可以在胎兒肝臟，肺和腸道中積累，表明LNP可以遞送mRNA以誘導肝臟產生治療性分泌蛋白。

4.3 神經系統疾病

Dhaliwal課題組開發了一種基于mRNA療法的陽離子脂質體，用于治療慢性疾病，其中脂質體由DOTAP，DPPC和膽固醇組成。評估了小鼠模型中，鼻內傳遞到大腦的潛力。結果證明了特異性非病毒mRNA遞送至腦部并治療各種神經系統疾病中的可行性

4.4 推進iPSC技術

安全誘導多能干細胞（iPSCs）的生產為再生療法的發展帶來了巨大的希望。Choi課題組利用GO-PEI復合物將mRNA高效遞送到脂肪組織衍生的成纖維細胞中，并成功開發了一種基于RNA的簡單iPSC生產技術。研究證實：基于GO-PEI遞送mRNA的iPSC生產技術可用于制備臨床安全且經濟上可行的iPSC，從而推動iPSC技術向臨床環境的轉化。

4.5 體內CAR-T細胞編輯

CAR-T療法就是嵌合抗原受體T細胞免疫療法，英文全稱Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy。這是一種治療腫瘤的新型精準靶向療法，近幾年通過優化改良在臨床腫瘤治療上取得很好的效果，是一種非常有前景的，能夠精準、快速、高效，且有可能治愈癌癥的新型腫瘤免疫治療方法。

2022年1月7日，Science期刊封面文章形式刊登了賓夕法尼亞大學研究者的最新研究，利用LNP為媒介靶向T細胞遞送mRNA，直接在體內構建CAR-T治療小鼠心衰癥狀。

研究者將編碼表達FAP CAR的mRNA通過LNP包裹并經CD5抗體介導靶向遞送至T細胞。CD5介導內吞到T細胞后，mRNA釋放并在T細胞膜表達FAP CAR，從而完成體內構建CAR-T的過程。mRNA注射至小鼠體內后，隨后mRNA分子被T細胞捕獲，使得T細胞獲得特異性靶向攻擊心肌成纖維細胞的能力。mRNA成功重編碼心衰小鼠的T細胞，導致心臟纖維化明顯減少，心臟的大小與功能也修復至接近正常的狀態。這種方式有效改善了心衰小鼠模型的心臟功能。

圖4. LNP遞送mRNA實現CAR-T細胞的體內生成

五、 展望

合成的mRNA在遞送到細胞質后經歷瞬時蛋白表達，可以通過生理代謝途徑完全降解，這可以避免基因組整合的風險。這種瞬態特征滿足了許多僅需要蛋白質表達有限時間的應用的需求，例如基因編輯，細胞重編程和一些免疫療法。不同的mRNA遞送系統具有不同的遞送機制。以脂質納米遞送系統為例，LNPs通過微流體制備方法將mRNA捕獲在核心中，并且主要通過內吞作用，溶酶體逃逸途徑遞送到細胞中。除脂質納米遞送系統外，其他納米遞送系統還具有自己的mRNA包埋策略和遞送特征，如聚合物復合物、膠束、陽離子肽等。然而，基于合成mRNA的療法也存在一些缺點，例如遞送效率低下和不穩定等問題。目前，受納米遞送系統有限的內體逃逸的阻礙，只有少量的mRNA（0.01%）可以成功進入細胞質并表達蛋白質，當然隨著自復制mRNA的引用，劑量問題勢必得到改善。同時，在不久的將來，凍干或其他藥物處理方法可能有助于解決這些問題，甚至能夠進行鼻腔、口服或呼吸給藥。mRNA納米遞送系統的給藥途徑對于確定mRNA疫苗在體內的代謝和靶抗原蛋白的翻譯效率非常重要。目前，mRNA疫苗是系統的或局部施用的，這取決于需要表達抗原蛋白的位置。預防性疫苗通常局部皮下和肌肉注射以誘導強烈的免疫反應，而治療性mRNA疫苗通常腹膜內或靜脈內給藥。此外，創新的多功能材料可能是應對mRNA應用挑戰的另一種解決方案。

綜上所述，COVID-19大流行將mRNA技術推向了世界，在關鍵時刻顯示出其獨特的優勢。這些技術是經過學術界和工業界科學家多年艱苦努力而開發的。雖然并不完美，但不可否認的是，mRNA療法已經準備好迎接它的閃耀時代，并向全面工業革命的過渡。

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[1]. Li M, Li Y, Li S, Jia L, Wang H, Li M, Deng J, Zhu A, Ma L, Li W, Yu P, Zhu T. The nano delivery systems and applications of mRNA. Eur J Med Chem. 2022 Jan 5;227:113910. doi: 10.1016/j.ejmech.2021.113910. Epub 2021 Oct 8. PMID: 34689071; PMCID: PMC8497955.