2021年4月15日，《cell》第8期184卷上刊出文章“Simultaneous binding of Guidance Cues NET1 and RGM blocks extracellular NEO1 signaling[1]”

摘要： 在細胞遷移和分化過程中，細胞的表面受體可以同時結合不同的配體，然而，對于如何整合這些細胞外信號的了解卻比較少。當Netrin-1（NET1）結合配體時，Neogenin（NEO1）會充當具有吸引力的引導受體，但它也會通過排斥性導向分子（RGM）介導排斥。文章揭示，通過三元聚合物（NEO1-NET1-RGM）復合物的形成進而整合了細胞外的信號并觸發了下游信號的相互沉默。作者通過NEO1-NET1-RGM結構揭示了存在于細胞膜中的“三聚體”超級組裝，并且這個超級組裝形成的三聚體會通過阻斷RGM-NEO1復合物形成的信號以及NET1誘導下的NEO1胞外聚集，進而抑制RGMA介導的生長錐塌陷以及RGMa或NET1-NEO1介導的神經元遷移。這些結果驗證了當兩個具有相反功能的配體與單個受體同時結合時，不會導致競爭性結合，而是會形成降低其功能的超級復合物。

圖1. “3-3”聚合體的作用示意圖

結果：為了剖析通過RGM和NET1相互作用控制NEO1信號傳導的分子機制，作者使用了表面等離子體共振（SPR）以及細胞表面結合實驗確定了NET1-NEO1相互作用的最小結合區域，測試表明，最小復合物由NEO1的三個靠近膜的FN結構域（NEO1FN456）以及一個缺少了C端的NTR結構域的NET1（NET1NTR）組成，這也與之前的研究結果一致。

圖2 NEO1、NET1、RGMB的示意圖

由于細胞可以在體內以依賴NEO1 的方式同時遇到 RGM 和 NET1，作者探究細胞表面是否存在穩定的三元NEO1-NET1-RGM復合物，或者NET1和RGM是否會競爭結合NEO1。為了探究這兩種區別，作者采用Proximity Ligation Assay（PLA）實驗，將經過細胞表達并純化的全長的NEO1與NETNTR以及全長的胞外RGMB進行相互培養，觀察到遇到PLA現象，并且只有當NET1與RGMB非常接近且距離＜40nm時才會產生。當RGMB突變為不可鏈接NET1時，PLA現象明顯減少。結果表明，NEO1是連接NET1和RGMB所必需的，并且會在細胞表面形成三元復合物。

圖3. NEO1-NET1-RGMB三聚體

為了揭示NEO1、NET1以及RGMB如何組裝成三元復合物，作者收集到復合物分辨率為3.25A晶體結構，并通過超速離心分析（AUC）和小角度X射線散射（SAXS）分析了“3-3”三聚體的溶液穩定性，最終確定了超級復合體3：3：3NEO1-NET1-RGMB的基本組成。

“3-3”超級復合體的主體本質上是由NEO1和NET1之間的相互作用形成的。NET1是細長的且剛性的分子，使得與兩個相鄰NEO1分子接觸，以彌合超復合物。冷凍電鏡結果顯示，有四個N連接上蔗糖，另外有四個位置通過非共價連接了八硫酸酯鹽（SOS）分子，蔗糖八硫酸酯協助確認三元聚合物超級復合體比例。NET1和RGMB分子形成非常小的相互作用，同時也未觀察到NET1與溶液中RGMA以及RGMB的相互作用。這也表明了NET1-NEO1相互作用是形成“3-3“超級復合體的驅動力。

圖4. 三元NEO1-NET1-RGM復雜聚合物的功能性分析

（C、D、E、F、G詳細標明蔗糖八硫酸酯鹽在復雜三聚體表面的結合位置）

之前的研究結果表明，RGMB對DCC的結合親和力比NEO1低約1000倍。在該研究中該研究團隊顯示在CNs中敲除DCC對RGMA誘導的生長錐塌陷沒有影響，也沒有影響NET1調節這種效應的能力。DCC缺失不影響NET1介導的神經細胞遷移，也不影響RGMA或RGMB抑制這種作用的能力。這支持RGM抑制可能歸因于三元NEO1-NET1-RGM復合物的觀點。NEO1與DCC一起的不同進化可以通過信號轉導中對三元NEO1-NET1-RGM復合物的需求來解釋。

該研究團隊的研究表明，NET1可以沉默RGMA介導的中樞神經系統生長錐塌陷，需要NEO1，RGMA和RGMB抑制NET1對神經細胞遷移的積極作用。NET1介導的神經細胞遷移在體外以劑量依賴性方式被RGMA抑制。這些數據表明NET1和RGMA和RGMB在功能上相互作用，并且它們的同時呈現導致其下游效應的相互沉默，這與三元復合物起到沉默受體信號傳導的作用一致。

該實驗也拓寬了蔗糖八硫酸酯鹽的應用范圍，在制備冷凍電鏡樣品或蛋白質修飾中均存在一定的應用價值。由于其獨特的負電性，可以在蛋白表面尋找可能的結合位點，并且通過分子量變化，進而確定多聚體蛋白質的組成，確定蛋白質復合物的各組分比例，為探索蛋白間的相互作用提供可能。

[1] Robinson RA, Griffiths SC, van de Haar LL, et al. Simultaneous binding of Guidance Cues NET1 and RGM blocks extracellular NEO1 signaling. Cell. 2021;184(8):2103-2120.e31. doi:10.1016/j.cell.2021.02.045